磷脂酶 D( Phospholipases D,PLD)试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
磷脂酶D(EC3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理
磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱,胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质,在 500nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 102mL×瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体 3mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂三:粉剂×1 支,-20℃避光保存。临用前加 1mL 无水乙醇充分溶解。
试剂四:液体 15mL×1 瓶,4℃避光保存。
标准品:液体 1mL×1 支,4℃避光保存。
酶液提取
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g 离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于 1mL 试剂一。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于 4℃,10000g 离心5min,取全部上清于4℃、100000g 离心30min,弃上清,取沉淀溶于 1mL 试剂一。
3. 血清:直接测定。
测定操作
| 空白管 | 标准管 | 测定管 |
试剂一(μL) | 20 |
|
|
试剂二(μL) | 30 | 30 | 30 |
标准品(μL) |
| 20 |
|
样品(μL) |
|
| 20 |
试剂三(μL) | 10 | 10 | 10 |
充分混匀,30℃反应 30min,沸水浴 1min,打开盖子,自然冷却 2min。 | |||
试剂四(μL) | 140 | 140 | 140 |
30℃反应 30min,于微量石英比色皿/96 孔板,空白管调零,测定 500nm 处吸光值,分别记 为 A 标准管和 A 测定管。 |
酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性(nmol/min/mg prot)= A测定管÷A标准管×C 标准÷Cpr÷T
= 0.017 ×A测定管÷A标准管÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性(nmol/min/g)=A测定管÷A标准管×C 标准÷W÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min/104cell)=A测定管÷A标准管×C 标准÷细胞数量÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性(nmol/min/mL)=A测定管÷A标准管×C 标准÷T=0.017×A测定管÷A标准管
C 标准:标准品浓度,500nmol/L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL;T:反应时间,30min
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性(nmol/min/mg prot)=A测定管÷A标准管×C 标准÷Cpr÷T
= 0.017 ×A测定管÷A标准管÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性(nmol/min/g)=A测定管÷A标准管×C 标准÷W÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min/104cell)=A测定管÷A标准管×C 标准÷细胞数量÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min/mL)=A测定管÷A标准管×C 标准÷T=0.017×A测定管÷A标准管
C 标准:标准品浓度,500nmol/L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL;T:反应时间,30min
注意事项
1. 试剂三置于-20℃保存,临用前配制,配置好的试剂三置于 4℃保存不超过7天。
2. 显色完成后,若有沉淀,于8000rpm,25℃离心5min后取上清测定。
3. 吸光值不宜超过1,否则用试剂一将酶液进行稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。