ELISA试剂盒
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本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 人（Human）流行性乙型脑炎病毒 IGM 抗体
（EEB IGM-Ab）ELISA 检测试剂盒
使用说明书
检测原理
试剂盒采用双抗原一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往 预先包被流行性乙型脑炎病毒抗原的包被微孔中，依次加入标本、 HRP标记的检测抗原，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在 过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄 色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUT OFF值相 比较，从而判定标本中流行性乙型脑炎病毒IGM抗体（EEB IGM-Ab）
的存在与否。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细 胞刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心
地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟 取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存 于-20℃ , 避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 自备物品
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒温箱
操作注意事项
1. 试剂盒保存在 2-8℃ , 使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解 后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保 存。
3. 预处理后的样本请按照操作步骤用样本稀释液适当稀释以达到 试剂盒的的最佳检测效果。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
| 名称 | 96 孔配置 | 48 孔配置 | 备注 |
| 微孔酶标板 | 12 孔×8 条 | 12 孔×4 条 | 无 |
| 阴性对照 | 0.5mL | 0.5mL | 无 |
| 阳性对照 | 0.5mL | 0.5mL | 无 |
| 检测抗原-HRP | 10mL | 5mL | 无 |
| 20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 |
| 底物 A | 6mL | 3mL | 无 |
| 底物 B | 6mL | 3mL | 无 |
| 终止液 | 6mL | 3mL | 无 |
| 封板膜 | 2 张 | 2 张 | 无 |
| 说明书 | 1 份 | 1 份 | 无 |
| 自封袋 | 1 个 | 1 个 | 无 |
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的 20×洗涤 缓冲液加 19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽 孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液 350 μL，浸泡 1min，洗板 5 次。 操作步骤
1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自 封袋密封放回4℃。
2. 设置阴、阳性对照孔和样本孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对 照、阳性对照各 50 μL；
3. 待测样本孔先加待测样本 50 μL5；
4. 随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP） 标记的检测抗原 100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温
箱温育 60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去 洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入终止液 50 μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。
结果判断
1. 试验有效性：阳性对照孔 OD 值平均值≥1.00； 阴性对照孔 OD 值平均值≤0.15。
2. 临界值（Cut off）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15
3. 阴性判断：样品 OD 值＜临界值（Cut off），样品为阴性
4. 阳性判断：样品 OD 值＞临界值（Cut off），样品为阳性
试剂盒性能
1. 准确性：阳性对照孔 OD 值平均值≥1.00；阴性对照孔 OD 值平 均值≤0.15，说明试验结果有效。
2. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 15%。
4. 贮藏：2-8℃ , 避光防潮保存。
5. 有效期：6 个月
